SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) adalah metode yang umum digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Proses SDS-PAGE melibatkan penerapan arus listrik pada sampel protein yang dimuat pada gel polyacrylamide dalam kondisi tertentu.
Berikut ini adalah beberapa tips dan trik untuk pembuatan larutan gel pada proses SDS-PAGE:
- Pilih konsentrasi gel yang sesuai: Pemilihan konsentrasi gel tergantung pada ukuran target protein yang akan dipisahkan. Untuk protein dengan ukuran kecil, gunakan gel dengan konsentrasi yang lebih tinggi, sedangkan untuk protein dengan ukuran besar, gunakan gel dengan konsentrasi yang lebih rendah.
- Gunakan SDS dalam larutan pengisi gel: SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) adalah zat yang penting dalam proses SDS-PAGE. Tambahkan SDS dalam larutan pengisi gel untuk memastikan denaturasi protein dan memberikan muatan negatif pada protein.
- Tambahkan agen reduksi: Beberapa protein dapat membentuk ikatan disulfida yang dapat mempengaruhi migrasi pada gel. Tambahkan agen reduksi seperti DTT (Dithiothreitol) atau β-mercaptoethanol dalam sampel untuk memutus ikatan disulfida dan memastikan migrasi protein yang akurat.
- Rendam gel dalam larutan elektroforesis: Setelah pembuatan larutan gel, rendam gel dalam larutan elektroforesis (biasanya berisi Tris-Glycine buffer) di dalam gel tank. Pastikan agar gel terendam sepenuhnya dan tidak ada gelembung udara yang terperangkap di bawah gel.
- Persiapkan sampel dengan baik: Sebelum dimasukkan ke dalam gel, sampel protein perlu dipersiapkan dengan baik. Denaturasi sampel protein dengan pemanasan pada suhu tinggi (biasanya sekitar 95°C) selama beberapa menit dan kemudian pendinginan cepat pada suhu rendah. Setelah itu, tambahkan buffer pengurangan dan buffer pemuatan (biasanya mengandung SDS dan bromofenol biru) ke dalam sampel dan campurkan dengan baik sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel.
- Gunakan berat protein standar: Untuk memperkirakan ukuran protein dalam sampel, gunakan berat protein standar yang mengandung protein dengan ukuran yang diketahui. Berat protein standar digunakan sebagai acuan untuk menghitung jarak migrasi protein pada gel.
- Pastikan kondisi elektroforesis yang tepat: Pastikan kondisi elektroforesis seperti voltase, arah migrasi, dan waktu elektroforesis yang tepat sesuai dengan kebutuhan eksperimen Anda.
- Gunakan pewarna untuk visualisasi: Setelah elektroforesis selesai, gunakan pewarna seperti Coomassie Brilliant Blue atau Silver Stain untuk memvisualisasikan protein pada gel. Pewarna ini akan memberikan kontras yang baik dan memungkinkan identifikasi protein dengan jelas.
Pastikan untuk mengikuti protokol dan petunjuk penggunaan yang sesuai saat membuat larutan gel pada proses SDS-PAGE.